EFECTIVIDAD DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN TIEMPO REAL (PCR-RT) E INMUNODOT EN EL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LEPTOSPIROSIS: ANÁLISIS COMPARATIVO CON LA PRUEBA DE MICROAGLUTINACIÓN (MAT)

Introducción

La leptospirosis es una enfermedad infecciosa causada por espiroquetas patógenas del género Leptospira que afecta a humanos y animales. Es una de las zoonosis más comunes del mundo^1,2. Se disemina a través de la orina de animales domésticos, principalmente roedores. Los factores de riesgo para la infección incluyen: exposición ocupacional (agricultores, ganaderos, trabajadores de mataderos, cazadores, veterinarios, leñadores, trabajadores de alcantarillado, arroceros, comerciantes de mascotas, militares, trabajadores de laboratorio, etc); actividades recreativas (en agua dulce, ríos, piscinas, canoas, ciclismo de montaña, etc); exposición doméstica (perros, ganado domesticado, sistemas de captación de agua de lluvia, infestación por roedores infectados, etc); u otros (caminar descalzo a través de aguas superficiales, lesiones de piel, contacto con roedores silvestres, exposición accidental, etc.).^2-6.

La incidencia en el trópico es aproximadamente diez veces mayor que en regiones templadas⁷. Se ha reportado que la incidencia anual oscila entre 0,1 y 1 por cada 100,000 personas residentes en las zonas templadas, a 10 o más por 100,000 en personas que viven en climas tropicales y hasta 100 o más por cada 100,000 personas cuando ocurren brotes⁸. La magnitud del problema en las regiones tropicales y subtropicales puede atribuirse, en gran medida, a las condiciones climáticas y ambientales⁹. El riesgo de brotes aumenta durante las temporadas ciclónicas e inundaciones¹⁰. En el 2007, en la República Dominicana, luego del paso de los huracanes Noel y Olga, se registraron 2,355 casos de leptospirosis, con una tasa de mortalidad de 24.8 por cada 100,000 habitantes. En el 2010, año en el cual no hubo procesos climatológicos de importancia, la tasa de morbilidad y la tasa de mortalidad descendieron a 2.3 y 0.3 por cada 100,000 habitantes, respectivamente¹¹. Además, esta enfermedad se reconoce como una causa de fiebre en turistas en los trópicos, incluyendo los visitantes de la República Dominicana¹².

El diagnóstico adecuado y a tiempo de la leptospirosis es aún problemático¹². Con frecuencia, esta enfermedad se presenta con síntomas y signos similares a otras enfermedades infecciosas, como dengue, malaria, chikungunya y zika¹³, por lo cual puede confundirse con facilidad. El curso clínico de esta varía desde una presentación asintomática, hasta un cuadro severo con alta mortalidad¹⁰. La mayoría de los casos son leves y autolimitados o subclínicos, pero algunos pueden complicarse de forma severa y ser potencialmente fatales. La enfermedad tiene un periodo de incubación de 2 a 26 días (en promedio 10 días) y se presenta generalmente con inicio abrupto, contracturas musculares, mialgias y cefaleas en un 75 a 100 % de los pacientes. Otros signos son eyección conjuntival, náuseas, vómitos, diarreas, faringitis, esplenomegalia, linfadenopatía, hepatomegalia, auscultación respiratoria anormal y erupciones en la piel. Generalmente, los hallazgos se atribuyen a la respuesta inmunológica del huésped, más que a la acción directa de la espiroqueta¹⁰. Algunos autores confirman que existen evidencias sólidas de que los mecanismos inmunopatológicos contribuyen a la evolución de la enfermedad^14-16.

Aunque los pacientes sospechosos tengan datos de historia de exposición, signos y síntomas sugestivos de leptospirosis y hallazgos de laboratorio que descarten posibles diagnósticos diferenciales, el diagnóstico de la enfermedad debe ser confirmado por pruebas de laboratorios específicas. Las pruebas habituales para leptospirosis son imprecisas y son foco de debate e investigación, particularmente las que podrían ser confirmatorias en las etapas tempranas de la enfermedad. Algunas técnicas moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) se recomiendan para contribuir al diagnóstico en su etapa temprana^17-18.

Cardona et al.,¹⁹ en un estudio sobre el diagnóstico de leptospirosis mediante PCR en pacientes con síndrome febril icterohemorrágico, encontraron que la PCR tiene un valor predictivo positivo de 40 % e indicaron que la PCR es capaz de detectar leptospiras en sangre antes de que los anticuerpos séricos puedan ser detectados. Encontraron, además, que la eficiencia de la PCR fue mayor en muestras de orina.

En algunos estudios que evaluaron la sensibilidad y especificidad de las pruebas diagnósticas, se encontró que la sensibilidad del cultivo fue de 10.5 %; la del test de microaglutinación (MAT), 49.8 %; y la sensibilidad de la combinación de ambas, 55.5 %. La PCR por sí sola, fue ligeramente más sensible (55 %). Sin embargo, la prueba de ensayo de flujo lateral tuvo una sensibilidad de 85.6 % y combinada con la PCR, mostró la mejor sensibilidad y especificidad: 93.2 % y 93.1 %, respectivamente. Estos autores sugieren que el uso de MAT subestima la incidencia y prevalencia de la leptospirosis²⁰.

Numerosas pruebas serológicas alternativas al MAT han sido desarrolladas. Algunos estudios favorecen el uso del IgM dot-ELISA y ELISA IgM como rastreo inicial rápido de la infección por Leptospira, con subsecuente confirmación con MAT^19-21.

En este sentido, la presente investigación, como objetivo primario, buscó evaluar la efectividad y validez diagnóstica de la Reacción en Cadena de Polimerasa en tiempo real (PCR-RT), IgM por Inmunodot y el test de Microaglutinación (MAT) para el diagnóstico temprano en pacientes con sospecha clínica de Leptospirosis Humana. Además, como objetivos secundarios, se buscó determinar la proporción de casos sospechosos de Leptospirosis Humana que tuvieron confirmación del diagnóstico por la prueba de MAT y caracterizar los datos sociodemográficos de los pacientes confirmados con la enfermedad.

Materiales métodos

Diseño del estudio

Se realizó un estudio observacional, descriptivo, de corte transversal de pacientes admitidos desde el año 2010 hasta el 2012 con diagnóstico presuntivo de leptospirosis en el Hospital Regional Universitario “José María Cabral y Báez” (HRUJMCB) de Santiago de los Caballeros, República Dominicana, para comparar la validez diagnóstica de tres pruebas de laboratorio para Leptospirosis Humana.

Participantes

La población de estudio estuvo compuesta por los adultos que acudían a la emergencia del HRUJMCB con cuadro clínico sugestivo de leptospirosis. Se utilizaron como criterios de inclusión las características clínicas vigentes para realizar un diagnóstico presuntivo de leptospirosis, descritas por las Normas Nacionales de Vigilancia Epidemiológica (fiebre de comienzo repentino, cefalea, escalofríos, mialgia intensa e inyección de conjuntivas). Se excluyeron los pacientes que resultaron positivos para otras enfermedades infecciosas, como Malaria, Hepatitis A, B y C. El estudio contó con la aprobación del Comité de ética del hospital de estudio y del Consejo Nacional de Bioética en Salud (CONABIOS). Se obtuvo un consentimiento o asentimiento informado de todos los pacientes.

Variables

Los parámetros generales que se emplearon para describir la población fueron los datos demográficos (edad, sexo, nacionalidad y lugar de residencia) e información clínica estandarizada para diagnóstico de leptospirosis (signos y síntomas). El diagnóstico de leptospirosis fue confirmado mediante las siguientes pruebas de laboratorio: Reacción en Cadena de Polimerasa en tiempo real (PCR-RT), IgM por Immunodot y el test de Microaglutinación (MAT). Se tomaron las muestras luego del ingreso del paciente al hospital.

La PCR-RT se analizó por medio del kit de extracción de ADN de Tejido de Oiagen y se envió a un laboratorio de Patología Molecular. La IgM Inmunodot se analizó mediante el kit de DST de Inmunodot. Para el test de Microaglutinación (MAT) la muestra fue tomada por el Departamento de Epidemiología del hospital y posteriormente enviada al Laboratorio Veterinario Central (LAVECEN) de la ciudad de Santo Domingo, República Dominicana. El tiempo aproximado para el traslado es de tres horas.

Análisis estadístico

La efectividad de la prueba de PCR-RT e Inmunodot fue evaluada usando los parámetros de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo, empleando la prueba de Microaglutinación (MAT) como prueba estándar o “gold standard”. Por otra parte, la relación entre la prueba MAT y la mortalidad fue calculada por medio de chi-cuadrado (X²), estimando que la asociación tiene significancia cuando el p-valor es <0.05.

Resultados

Se evaluaron 250 pacientes, de los cuales 69 cumplieron con los criterios de elegibilidad. De estos 69, en 6 casos no se obtuvo el resultado del MAT, para un 8,69 % del total de muestras. Se observó que la mayoría de los casos eran hombres (94.2 %) menores de 49 años (79.4 %) (tabla 1). El lugar de procedencia más frecuente fue la ciudad de Santiago de los Caballeros (58 %) (tabla 1). Los serotipos más frecuentes de Leptospira identificados por la prueba MAT fueron: 1) Leptospira Grippo (18.1 %); Leptospira pomona (15.1 %); y Leptospira Ictero-haemorragiae con 4 casos (12.1 %) (tabla 1).

Para el análisis de sensibilidad se empleó el test de MAT como prueba de oro y se compararon las pruebas de PCR-RT e Inmunodot. Los resultados pueden visualizarse en la tabla 2 y en el gráfico o figura 1.

Al realizar el test de MAT, 33 pacientes (52.4 %) resultaron positivos para la enfermedad (tabla 2). La prevalencia de la enfermedad según la prueba PCR-RT fue 23.8 % (tabla 2), mientras que la sensibilidad fue 27 % (ideal 80 %), la especificidad de 80 % (ideal 90 %), el valor predictivo positivo de 60 % (ideal 100 %) y el valor predictivo negativo de 50 % (ideal 100 %) (tabla 2). La prevalencia de la enfermedad según la prueba de Inmunodot fue de 28.6 % (tabla 2) y la sensibilidad fue de 48 % (ideal 80 %), la especificidad de 93 % (ideal 90 %), el valor predictivo positivo de 89 % (ideal 100 %), y el valor predictivo negativo de 62.2 % (ideal 100 %) (tabla 2).

La mortalidad por leptospirosis fue alta; 35 pacientes (55.5 %) murieron. La relación entre la prueba MAT y la mortalidad no fue significativa (p=0.208) (tabla 3).

Discusión

El presente estudio muestra que en República Dominicana los casos hospitalizados con diagnóstico presuntivo de leptospirosis presentan una muy alta mortalidad. El hecho de encontrar una alta proporción de pacientes que fallecieron con pruebas para Leptospira negativa sugiere que se debe investigar la posibilidad de otras afectaciones en dichos individuos. Se recomienda realizar la prueba de Hanta Virus, particularmente en pacientes sospechosos para leptospirosis con datos de hemorragia pulmonar y afección renal, puesto que se ha demostrado la relación entre ambas^22,23.

Al igual que en otros estudios, en el presente trabajo las pruebas para el diagnóstico temprano de la leptospirosis como el PCR-RT e Inmunodot fueron poco efectivas y es necesario implementar o encontrar nuevas pruebas diagnósticas^24,25. Estudios sugieren mejores resultados utilizando el PCR-RT en orina¹⁹. En cambio, la prueba que recientemente ha reportado una mayor sensibilidad (85.6 %) es la prueba de ensayo de flujo lateral y la combinación de esta con el PCR-RT mostró la mayor sensibilidad y especificidad (93.2 % y 93.1 %, respectivamente)²⁰.

Hallazgos recientes con la prueba de Leptocheck-WB (prueba de IgM basada en inmunocromatografía) muestran una alta sensibilidad y aseguran que es efectiva para realizar el diagnóstico de leptospirosis de manera rápida y fácil²⁶. Con estos hallazgos, pareciera que la opción ideal para confirmar o descartar la enfermedad podría ser la realización de la prueba de Leptocheck-WB para tamizaje, realización de la prueba de flujo lateral y PCR-RT para confirmación y el test de MAT para identificación de las cepas de leptospirosis.

Conclusiones

Considerando la alta morbimortalidad en los casos sospechosos de leptospirosis ingresados en hospitales públicos de la República Dominicana y la deficiencia demostrada de pruebas diagnósticas confirmatorias en etapas tempranas de la enfermedad, se justifica continuar investigando sobre este tópico en el país.

Es necesario aumentar los esfuerzos para optimizar el diagnóstico y el tratamiento en casos de Leptospirosis Humana en República Dominicana, mediante la actualización del protocolo de manejo y la garantía de su implementación. El Servicio Nacional de Salud necesita contar con laboratorios modernos para el diagnóstico confirmatorio de la leptospirosis en las diferentes regiones del país, para con esto agilizar y garantizar fiabilidad de los resultados del diagnóstico. Además, se hace necesario caracterizar otras causas de cuadros clínicos similares a la leptospirosis en el país, como, por ejemplo, los causados por Hantavirus, considerando el hecho de los casos afectados que mostraron resultados negativos del test de MAT y que manifestaron alteraciones renales y pulmonares. También se sugiere restablecerse la realización de autopsias en los pacientes fallecidos por la enfermedad, para un mejor entendimiento de la misma²⁷.

Por otra parte, recomendamos profundizar en el tema con más investigaciones sobre la asociación entre la aparición de las complicaciones y la mortalidad por leptospirosis con las variables demográficas, el tipo de Leptospira y las alteraciones de laboratorio.

Financiación

El presente estudio fue realizado con el auspicio del Fondo de Incentivo a la Investigación Científica y Tecnológica (FONDOCYT) del Ministerio de Edu- cación Superior, Ciencia y Tecnología (MESCYT) de la República Dominicana.