INHIBICIÓN DE LA OXIDACIÓN IN VITRO DE LIPOPROTEÍNAS DE BAJA DENSIDAD (LDL), POR EXTRACTOS ACUOSOS DE CAMELLIA SINENSIS E HIBISCUS SABDARIFFA

Introducción 

El té verde (Camellia sinensis) y la flor conocida como rosa de jamaica (Hibiscus sabdariffa), están considerados entre las tres primeras bebidas de mayor consumo después del agua, y su popularidad ha crecido por sus diversas potencialidades y efectos a la salud ¹,². Entre las propiedades que se les atribuyen están sus efectos antiinflamatorio, antimicrobiano, anticancerígeno, antioxidante, hipoglicemiante y, en especial, su capacidad de hipolipemiante³-⁵. Las actividades bilógicas anteriormente señaladas son gracias a su alto contenido en compuestos bioactivos como los polifenoles, que son un grupo cercano a 8.000 sustancias y que pueden ser clasificados de acuerdo con su estructura. Entre los más importantes están los flavonoides, que poseen una estructura básica C6-C3-C6, las antocianinas, catequinas y epicatequinas, estas últimas predominantes en C.sinensis ⁶-⁸.

Con relación a la lipoproteína de baja densidad (LDL), se sabe que esta es avalada por estudios epidemiológicos y de intervención como mejor predictor de la enfermedad cardiovascular y coronaria que el colesterol total ⁹,¹⁰. Sobre estas evidencias se han apoyado las guías de práctica clínica, donde se considera el LDL como el objetivo terapéutico principal, y se establece en función del nivel de riesgo del paciente, un nivel objetivo definido ¹¹.

Todo lo expuesto anteriormente y considerando que en Venezuela hasta la fecha no hay reportes de estudios similares, se propuso evaluar el efecto inhibitorio de estos extractos en LDL obtenidas de plasmas de pacientes con hiperlipidemia.

Material y métodos

Material vegetal

Se emplearon hojas de té verde orgánico procedente de China los cuales permanecieron en su envase original hasta su procesamiento. Por otra parte, los cálices de H. sabdariffa, fueron obtenidos de plantaciones propias por los investigadores, en el estado Aragua, Venezuela, entre junio y diciembre de 2019. Estos fueron deshidratados y almacenados libre de humedad, hasta su análisis en el Laboratorio de Metales Pesados y Solventes Orgánicos de la Universidad de Carabobo, sede Aragua (figuras 1 y 2). 

Obtención de los extractos acuosos  

Los extractos se prepararon con 2,5 g de material vegetal y 100 mL de agua destilada. Se dejó hervir por 15 minutos, se separó el líquido del resto de material vegetal por decantación y la extracción se repitió en las mismas condiciones por triplicado. Los extractos se filtraron con papel Whatman No. 4 y se aforó a 200 mL con agua destilada ¹². 

Obtención de las lipoproteínas de baja densidad en plasma (LDL)

Se realizó la extracción sanguínea, previa asepsia y empleando un tubo de tapa morada con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) sellado al vacío con aguja vacutainer. Estas muestras fueron obtenidas de cinco pacientes de los cuales uno de ellos no presentaba hiperlipidemia (todos en ayuna de 8 horas). A cada paciente se le explicó el propósito de la investigación, obteniendo así su consentimiento informado, siguiendo los lineamientos de la Declaración de Helsinki y del Consejo Técnico del Centro de Estudio en Salud de los Trabajadores de la Universidad de Carabobo.  

Determinación de fenoles totales

La determinación de fenoles se realizó por el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu. 50 µL de muestra fueron adicionados a 125 µL del reactivo de Folin, y 400 µL de carbonato de sodio 7,1 % (p/v), completándose con agua destilada hasta 1 mL. Este procedimiento se realizó por quintuplicado. Seguidamente se prepararon 5 patrones de concentración de 50, 100, 150, 200 y 250 µg/mL, a partir de una solución patrón madre de Ácido Gálico (fenol) de concentración 500 µg/mL. Por último, se realizó la lectura a 760 nm empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (Thermo Scintific). Los resultados se expresaron como mg de GAE / g de material vegetal (MV)¹³.

Ensayo de oxidación de LDL 

Los tubos se agitaron con un vórtex y llevados a una temperatura de 2 °C durante 15 min, para luego ser nuevamente agitados y centrifugados a 5000 rpm a 4 °C durante 5 min. El sobrenadante que corresponde al plasma se transfirió volumétricamente a un tubo falcon estéril de 15 mL y se adicionó el reactivo precipitante (ácido fosfotúngstico 500 mM y cloruro de magnesio 500 mM) en relación 2:1 v/v con el plasma obtenido. El reactivo precipitante y el plasma se agitaron durante 2 min en vórtex y, posteriormente, se centrifugaron a 3000 rpm a 4 °C durante 10 min. El sobrenadante obtenido (LDL) este se con buffer de fosfatos 10 mM y 0,16 M de NaCl, pH 7,4 hasta 100 mL. Seguidamente se llevó a cabo la oxidación de las LDL que consistió en tomar 115 μL de solución de LDL, 100 μL de extracto acuoso con buffer de fosfatos, 235 μL de buffer de fosfatos salino y 50 μL de CuSO4 100 μM, el cual actúa como oxidante de las LDL. La mezcla se agitó en vórtex durante 2 min y luego se incubó a 37 °C en agitación durante 8 h. Para detener la oxidación las muestras fueron transferidas por una columna de Sephadex G-50, tomando 550 μL del eluido y 500 μL de ácido tricloroacético (ATA) 25 % p/v. Posteriormente, se adicionaron 500 μL de ácido tiobarbitúrico 1 % p/v. Se agitó nuevamente en vórtex durante 1 min y se incubó a 95 °C por 1 h en oscuridad. Luego, se dejó enfriar durante 1 h, en oscuridad a temperatura ambiente (25 °C) y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min. Se realizó una curva de calibración del método de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) y se utilizó como estándar 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP) en concentraciones de 0,5 a 10 μM. Se midieron las absorbancias de las muestra, patrones, control (paciente sin hiperlipidemia) y los resultados se expresaron como μg TMP/100 g de MV ¹⁴,¹⁵. 

Análisis estadístico

Todas las determinaciones de las muestras y control se realizaron por triplicado. Para comparar cada efecto del extracto respecto a su control de cada paciente, se aplicó un análisis de varianza de dos vías con interacción (ANOVA), usando el programa Statistix 9.0 para Windows. 

Resultados 

La determinación de fenoles totales arrojó concentraciones de 150,03±2,23 mg de GAE/g de MV para C. sinensis y 14,12±1,03 mg de GAE/g de MV para H. sabdariffa. La evaluación de los extractos en la inhibición de la oxidación de las LDL, evidenció que para cada uno de los ensayos la oxidación fue estadísticamente significativo (p≤0,05) al comprarse con el control, siendo el extracto de C. sinensis donde más se observó el efecto inhibitorio (figuras 3 y 4).

Discusión

El efecto observado en los ensayos, evidencian que los compuestos bioactivos presentes en C. sinensis e H. sabdariffa, poseen una capacidad antioxidante semejante a lo hallado en diversos estudios y superior a lo reportado en extractos de frutas tropicales como curuba (Passiflora tripartida var. Mollissima), gulupa (Passiflora edulis Sims), aguacate variedad Hass (Persea America Mill), lulo (Solanum quitoense Lam.), tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) y uchuva (Physalis peruviana L) ¹⁶,¹⁷. Es importante señalar que la actividad antioxidante observada en ambos extractos está en relación con la concentracion de los compuestos fenólicos presentes en el material vegetal, los cuales varían de una cosecha a otra debido factores climaticos, calidad del suelo, uso de fertilizantes, genética de la planta entre otros. ¹⁸

En este sentido, se evidenció una mayor inhibición de la oxidación de las LDL, con el extracto de té verde orgánico que con el extracto de H.sabdariffa, en cada una de las muestras de los pacientes con hiperlipidemia, esto debido a su alto contenido en antioxidantes, entre los que destacan: epicatequina, galato de epicatequina, epigalocatequina y galato de epigalocatequina, a diferencia de de H.sabdariffa donde el responsable de dicha acción son las antocianinas 2,19. Si bien otros estudio han evaluado la capacidad de reducir los niveles de LDL, colesterol total y triglicéridos por medio de ingesta regulada de infusiones de C. sinensis e H. sabdariffa, todos concluyen que la biodisponibilidad (ingesta), el metabolismo y factores genéticos (polimorfismo de enzimas) son fundamentales, de ahí la importancia de evaluarlos de la mano al tratamiento, para obtener los efectos benéficos a la salud en pro de evitar problemas cardiovasculares a causa de la oxidación de estas lipoproteínas ²⁰-²³.

Conclusiones

El uso de infusiones a base de hojas de té verde y cálices de H. sabdariffa, son una alternativa indiscutible en el consumo de compuestos bioactivos.

A pesar que el efecto esperado in vivo a lo hallado en in vitro, no suele ser tan fácil por la biodisponibildad de estos antioxidantes en la dieta diaria, el control y la supervisión por expertos en el consumo de estas infusiones puede traer una mejoría significativa al ser humano y reducir eventos cardiovasculares.