La presente investigación fue llevada a cabo bajo la modalidad descriptiva-experimental. En primer lugar, se determinó la concentración de compuestos fenólicos totales (CFT), flavonoides totales (FT) y antocianinas que posee el material vegetal de las cinco especies en estudio, H. sabdariffa, H. rosasinensis, H. arnottianus, H. cannabinus e H. mutabilis. Partiendo de la concentración de CFT obtenida, se procedió a preparar cinco concentraciones (diluciones seriadas) de los extractos acuosos de las cinco especies del género Hibiscus antes señaladas (variable independiente) para proceder a determinar su efecto sobre una suspensión de glóbulos rojos (variable dependiente), a fin de evaluar la actividad antioxidante por métodos químicos y biológicos, y por otro lado determinar la actividad hemolítica y antihemolítica que ejercen los extractos sobre la suspensión.

El material vegetal estuvo constituido por los pétalos de cuatro especies del género Hibiscus y los cálices de H. sabdariffa. La recolección se realizó a partir de los arbustos de las especies H. sabdariffa, H. rosa-sinensis, H. arnottianus, H. cannabinusy H. mutabilis, y también de cálices deshidratados de H. sabdariffa, los cuales fueron secados y almacenados a temperatura ambiente, con escasa aireación y bajo sombra, para evitar la acción del oxígeno, la luz, la temperatura y microorganismos; factores que podrían transformar los compuestos originales en artefactos (Hostettmann, 2008). Posteriormente, fueron procesados en el Laboratorio de Metales Pesados de la Universidad de Carabobo Sede Aragua.

Una vez obtenidos los pétalos totalmente deshidratados de las especies de Hibiscus en estudio, se procedió a triturarlos manualmente usando una bola molino, hasta obtener un tamaño de partícula menor a 1 mm. Posteriormente, se pesaron 2,5 g del material vegetal, se colocaron en un vaso de precipitado con 250 mL de agua destilada y se llevaron a una plancha de calentamiento a 150 °C hasta su ebullición. Luego, se dejó enfriar a temperatura ambiente, y se procedió a filtrar utilizando papel de filtro Whatman número 4 (Pacheco et al., 2020).

Para llevar a cabo la separación de células sanguíneas humanas, se procedió a la extracción de 5 mL de sangre de la vena del antebrazo de un donante. La muestra fue colocada en un tubo con el anticoagulante etilendiaminotetraacético (EDTA). El proceso para la separación de los eritrocitos comenzó con la centrifugación de la sangre por 5 minutos a 1500 rpm (rotor Beckman® JA-20), a temperatura ambiente; se manípulo con sumo cuidado, para evitar riesgo de hemólisis. Se descartó el plasma y luego se tomó 1 mL del paquete celular, se dividió en dos alícuotas de 500 μL (A y B) que se lavaron con 600 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para descartar el resto del plasma. Se resuspendieron en PBS glucosilado para luego ser centrifugados a 1500 rpm por 12 minutos (Goyal et al., 2012). La suspensión final de eritrocitos se utilizó para los ensayos de evaluación de actividad hemolítica y antihemolítica.

La determinación de compuestos fenólicos totales se realizó mediante el Método colorimétrico de Folin-Ciocalteu en el material vegetal de las especies de Hibiscus en estudio. Para ello, se procedió a mezclar 50 µL de cada uno de los extractos acuosos con 125 µL del reactivo de Folin y 400 µL de carbonato de sodio al 7,1% (m/v), completándose con agua destilada hasta 1 mL. Este procedimiento se realizó por quintuplicado. Por consiguiente, se prepararon cinco patrones a concentraciones de 50, 100,150, 200 y 250 µg/mL, a partir de una solución patrón madre de ácido gálico con 500 µg/mL. La lectura se realizó en un espectrofotómetro a 760 nm, expresándose los resultados como mg de ácido gálico equivalente en 100g de material vegetal (Peluso y Serafini, 2017).

Para la determinación de flavonoides mediante el método colorimétrico, se procedió según lo establecido por Marinova et et al. (2005). En primer lugar, se mezclaron 100 µL del extracto acuoso con 30 µL de NaNO₂ al 5% (m/v), 30 µL de AlCl₃ 10% (m/v), 200 µL de NaOH 1 M; ajustando con agua destilada hasta un volumen final de 1 mL. Posteriormente, se realizó la lectura a 510 nm y se comparó con la curva patrón usando como estándar catequina. Los resultados se expresaron como equivalente de catequina en mg/g de material vegetal.

La determinación de Antocianinas se emplea con 1 ml de cada extracto y se añadió a 5 ml agua destilada a una temperatura de 50 0C. Posteriormente una vez alcanzada la temperatura ambiente se le añadió 1 ml de solución de cloruro férrico al 0,1%. De acuerdo al aspecto de color verde pardusco o coloración azul negro confirma la presencia de antocianinas valor que se expresa en forma de cruses (EL-Farmawi D et al., 2013).

Para la actividad antioxidante se empleó el método del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (Sigma Aldrich Co®) con una solución 100 µM de DPPH en metanol al 80%, la cual permite observar una disminución de la absorbancia, debido a la cesión de un átomo de hidrógeno por parte de los compuestos antioxidantes presentes en los extractos. En una cubeta de vidrio se colocó 100 µL de extracto acuoso y 2,9 mL de DPPH. La absorbancia fue monitoreada cada 5 min por 30 min a una longitud de onda de 515 nm. La absorbancia de referencia (A₀) se obtuvo al sustituir el volumen de extracto por metanol al 80%. El porcentaje de reducción de DPPH se obtuvo de la expresión: DPPH (%) = (A₀ - An) 100 / A₀, donde A₀ y An serán las absorbancias de referencia y de la muestra, respectivamente. Se empleó una solución patrón ácido ascórbico (vitamina C) (Pacheco-Coello et al., 2020).

Para este ensayo se empleó plasma, el cual se transfirió a un tubo falcon estéril de 15 mL y se adicionó el reactivo precipitante (ácido fosfotúngstico 500 mM y cloruro de magnesio 500 mM) en relación 2:1 v/v con el plasma obtenido. El reactivo precipitante y el plasma se agitaron durante 2 min en vórtex y, posteriormente, se centrifugaron a 3000 rpm a 4 °C durante 10 min. El sobrenadante obtenido (LDL) este se con buffer de fosfatos 10 mM y 0,16 M de NaCl, pH 7,4 hasta 100 mL. Seguidamente se llevó a cabo la oxidación de las LDL que consistió en tomar 115 μL de solución de LDL, 100 μL de extracto acuoso con buffer de fosfatos, 235 μL de buffer de fosfatos salino y 50 μL de CuSO₄ 100 μM, el cual actúa como oxidante de las LDL. La mezcla se agitó en vórtex durante 2 min y luego se incubó a 37 °C en agitación durante 8 h. Para detener la oxidación las muestras fueron transferidas por una columna de Sephadex G-50, tomando 550 μL del eluido y 500 μL de ácido tricloroacético (ATA) 25 % p/v. Posteriormente, se adicionaron 500 μL de ácido tiobarbitúrico 1 % p/v. Se agitó nuevamente en vórtex durante 1 min y se incubó a 95 °C por 1 h en oscuridad. Luego, se dejó enfriar durante 1 h, en oscuridad a temperatura ambiente (25 °C) y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min. Se realizó una curva de calibración del método de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) y se utilizó como estándar 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP) en concentraciones de 0,5 a 10 μM. Se midieron las absorbancias de las muestra, patrones, control (paciente sin hiperlipidemia) y los resultados se expresaron como μg TMP/100 g de MV (Ruiz et al., 2006; Da-Costa-Rocha et al., 2014)

Para la evaluación de la actividad hemolítica de los extractos acuosos, se utilizó con el extracto puro y con concentraciones de 5, 10, 15, 20, 25, 30 mg de ácido gálico (fenol)/ml. Se tomó un volumen de 500 μL de suspensión de glóbulos rojos y se incubó con 500 μL de la combinación del extracto puro y de cada concentración por 5 min a 37 ºC; después de este tratamiento, se centrifugó 8.000 rpm durante 12 minutos y el sobrenadante fue usado para medir la hemoglobina libre a una longitud de onda 540 nm, empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (ThermoScientific). Se empleó un control de hemólisis (≈100%) y no hemólisis (≈0%), usando H₂O₂ al 3% y solución salina al 95% (NaCl) (Pacheco-Coello et al., 2021).

Para la evaluación de la actividad antihemolítica de los extractos acuosos, se utilizó con el extracto puro y con concentraciones de 5, 10, 15, 20, 25, 30 mg de ácido gálico (fenol)/mL. Del extracto puro y de cada una de las diferentes concentraciones, se tomó 1 mL y se combinó con 1mL de H₂O₂ al 3%, incubándose durante 5 minutos a 37 ºC. Posteriormente, un volumen de 200 μL de suspensión de glóbulos rojos se incubó con 800 μL de la combinación del extracto y el H₂O₂, durante 5 minutos a 37 ºC; después de este tratamiento, se centrifugó a 8.000 rpm durante 12 minutos y el sobrenadante fue usado para medir la hemoglobina libre a una longitud de onda 540 nm, empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (ThermoScientific). Se empleó un control de hemólisis (≈100%) y no hemólisis (≈0%), usando H₂O₂ al 3% y solución salina al 95% (NaCl) (Pacheco-Coello et al., 2021).

Se procedió según lo descrito en el punto anterior, pero combinando el extracto puro con las diluciones de 1 mL de CaCO₃ al 5%, incubándose por 5 minutos a 37 ºC. Se tomó, un volumen de 200 μL de suspensión de glóbulos rojos se incubó con 800 μL de la combinación del extracto y el CaCO₃, durante 5 minutos a 37 ºC; después de este procedimiento, se centrifugó a 8.000 rpm durante 12 minutos y el sobrenadante fue usado para medir la hemoglobina libre a una longitud de onda 540 nm, empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (ThermoScientific). Se empleó un control de hemólisis (≈100%) y no hemolisis (≈0%), usando CaCO₃ al 5% y solución salina al 95% (NaCl) (Pacheco-Coello et al., 2021).

Las determinaciones de compuestos fenólicos totales y flavonoides se realizaron por triplicado, expresándose como medias ± desviación estándar. Referente a la actividad antihemolítica, se aplicó un análisis de varianza de dos vías con interacción (ANOVA), usando el programa Statistix 9.0 para Windows. El intervalo de confianza fue del 95% siendo estadísticamente significativo si p≤0,05.

La caracterización fitoquímica de los extractos determino que las especies H. cannabinus e H. sabdariffa fueron las que presentaron la mayor concentración de biomoléculas, mientras que la especie H. arnottianus, presentó el menor contenido de compuestos fenólicos totales y flavonoides totales, sin detección de antocianinas (tabla 1).

En la figura 1, se observa que los extractos de H. sabdariffa y H. cannabinus fueron los que presentaron el mayor porcentaje de reducción de DPPH, muy semejantes al control de ácido ascórbico (vitamina C). Así mismo el análisis estadístico arrojo diferencia estadística en la capacidad de reducción de estas tres especies respecto al control de no reducción (DPPH solo) Para los extractos de las otras especies, el porcentaje de reducción resultó ser el más bajo, lo que se asocia a su bajo contenido en compuestos antioxidantes.

Respecto al efecto los estratos de inhibir la oxidación de las LDL, se observóvó que los extractos H. sabdariffa e H. cannabinus fueron los que mostraron una mayor capacidad de inhibir la oxidación de las lipoproteínas con valores de p=0,012 y 0,009 (Figura 2).

En la figura 3, se observa como los extractos acuosos de las especies H. sabdariffa y H. cannabinus presentaron un porcentaje de hemólisis significativamente mayor frente a las otras especies en estudio, en el orden del 70% de hemólisis. Para los extractos de las otras tres especies, el porcentaje de hemólisis estuvo por debajo del 20 %. El análisis estadístico arrojó que los porcentajes de las especies H. rosa-sinensis, H. mutabilis, H. arnotitanus fueron estadísticamente diferentes respecto al control de no hemólisis del cloruro de sodio (NaCl).

Los ensayos de la evaluación de la actividad antihemolítica de los extractos arrojaron que las especies H. sabdariffa y H cannabinus presentaron una mayor protección al emplearse diluidos 1/4 y 1/8, con diferencia estadística (**p<0,05) respecto al control de hemólisis constituido por el H₂O₂. Para las especies H. rosa-sinensis, el porcentaje de inhibición estuvo alrededor del 60%, sin diferencia significativa (p>0,05). Referente a las especies H. mutabiulisy H. arnottianus, no se observó inhibición significativa de la hemólisis (p>0,05) (figura 4). Así mismo en la figura 5 se observa el patrón de antihemólisis para H. cannabinus.

En relación al efecto antihemolítico en presencia de CaCO₃, se observó un comportamiento semejante para las especies de H. sabdariffa y H. cannabinus. Para H. rosa-sinensis hubo disminución de la hemólisis en las dos últimas diluciones del extracto. Las especies mutabiulis y arnottianus resultaron ser las dos especies con el mejor comportamiento frente al CaCO_3, observándose hemólisis sólo en la última dilución (Figura 6). Por otra parte en la figura 7 se observa el patrón de antihemolítico de H.mutabilis