DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES ORGÁNICOS PERSISTENTES EN LECHE DE VACA DE PRODUCCIÓN NACIONAL POR MEDIO DE LA TÉCNICA DE CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (GC/MS)

Introducción

Las sustancias químicas conocidas como contaminantes orgánicos persistentes (COP) son el centro de atención internacional a causa de la creciente evidencia científica que sustenta que estos pueden provocar afecciones como el cáncer, daños en los sistemas nerviosos central y periférico, enfermedades del sistema inmune, desórdenes reproductivos, trastornos metabólicos y alteraciones en el desarrollo normal de bebés y niños (Secretariat of the Stockholm Convention, 2019). Además, estos compuestos son capaces de persistir en el medio ambiente, transportarse a larga distancia a través de la atmósfera, bioacumularse en tejidos humanos y animales y biomagnificar sus concentraciones en las cadenas alimentarias (World Health Organization (WHO) Persistent organic pollutants (POPs), 2014). Los COP han sido ampliamente utilizados en diversas actividades humanas; como plaguicidas, en distintos procesos farmacéuticos, y en la generación de productos y subproductos químicos en varias industrias. En particular, los COP incluyen diferentes tipos de especies químicas tales como, los pesticidas organoclorados, las dibenzo-dioxinas policloradas (PCDD), los dibenzo-furanos policlorados (PCDF) y los bifenilos policlorados (PCB) (Secretariat of the Stockholm Convention, 2017).

En consecuencia, se ha generado una exposición sostenida de muchas especies, incluidos los seres humanos, durante períodos de tiempo que abarcan generaciones. Con el fin de mitigar los efectos adversos que producen estas sustancias fue creado el tratado mundial conocido como el Convenio de Estocolmo en el que los países participantes, incluyendo la República Dominicana, acordaron eliminar o reducir la producción, el uso y la liberación de los COP. Distintas actividades, tales como el uso de pesticidas organoclorados, la quema de desechos y el uso de transformadores y capacitadores eléctricos han contribuido a la dispersión de los COP en el país (Sbriz, Aquino, Rodriguez, Fowler, & Sericano, 1998; Secretaría de Estado de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARENA), 2008).

En concreto, la exposición de los seres humanos a los COP ocurre principalmente a través de alimentos contaminados, en especial de aquellos de origen animal con un alto contenido en grasa (Lee et al., 2006). En consecuencia, organizaciones internacionales como la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA), la Unión Europea (UE) y el Codex Alimentarius de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO por sus siglas en inglés) han creado estándares donde se establecen los límites máximos de residuos (LMR) de COP permitidos en los alimentos (Codex Alimentarius of Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization (FAO/WHO), 2020; European Commission, 2020; United States Environmental Protection Agency (US EPA), 2020). Debido a la necesidad de estudiar los efectos adversos en los seres humanos producidos por el consumo de alimentos contaminados con dichas sustancias, diversas técnicas analíticas han sido utilizadas para su detección e identificación (Fernández-Alba & García-Reyes, 2008; Hernández, Grimalt, Pozo, & Sancho, 2009; Lacina, Urbanova, Poustka, & Hajslova, 2010; Polgár et al., 2012). Sin embargo, el método de extracción rápido, fácil, económico, eficaz, robusto y seguro (QuEChERS, por sus siglas en inglés) y la técnica analítica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masa (GC/MS, por sus siglas en inglés) son las herramientas más empleadas en la actualidad debido a sus destacadas ventajas de flexibilidad, rapidez, economía, facilidad, eficiencia y robustez, alta sensibilidad, exactitud y versatilidad (Chen, Lin, Dang, & Puschner, 2017; Jawaid, Talpur, Nizamani, Khaskheli, & Afridi, 2016; Rahman et al., 2018; Selvi, Paramasivam, Rajathi, & Chandrasekaran, 2012). En particular, abundantes estudios científicos evalúan el contenido de COP en productos lácteos como la leche e incluso se han detectado concentraciones por encima de los LMR establecidos internacionalmente (Battu, Singh, & Kang, 2004; Chen et al., 2017; Dagnac, Garcia-Chao, Pulleiro, Garcia-Jares, & Llompart, 2009; Fromberg, Granby, Højgård, Fagt, & Larsen, 2011; Jawaid et al., 2016; Martins, Amaya Chávez, Waliszewski, Colín Cruz, & García Fabila, 2013; Rahman et al., 2018; Rawash et al., 2018; Selvi et al., 2012).

Por el contrario, en la República Dominicana el número de investigaciones sobre la presencia de COP y sus efectos sobre la población son muy escasos y antiguos (Rodríguez, De Pratt, Peña, & Beltré, 2006; Sbriz et al., 1998; Subsecretaría de Estado de Recursos Naturales de la Secretaría de Estado de Agricultura (SEA-SURENA), 1999). Se cree que la liberación y el uso de estas sustancias tóxicas ha disminuido al pasar de los años debido a la implementación de normativas que regulan el manejo de los COP. No obstante, se desconoce la situación real de los COP en el país. Es por ello que, este estudio tuvo el objetivo de determinar la presencia de 34 COP en cinco marcas de leche de vaca producidas nacionalmente con la finalidad de obtener información certera y confiable a través de la aplicación de técnicas analíticas sensibles y eficaces sobre el grado de exposición a los COP en alimentos que presenta la sociedad dominicana.

Materiales y métodos

Reactivos y muestras

Esta investigación determinó en las muestras de leche de vaca la presencia de los siguientes COP: aldrín, clordano, decabromobifenil, diclorodifenildicloroetano (DDD), diclorodifenildicloroetileno (DDE), diclorodifeniltricloroetano (DDT), dieldrín, endosulfán, endrín, heptacloro, hexabromobifenilo, hexabromociclododecano (HBCD), hexaclorobenceno, hexaclorociclohexano (HCH), lindano (gamma-HCH), mirex, toxafeno y los siguientes congéneres de PCB: 2,3,3’,4,5’-pentaclorobifenilo (PCB 122), 2,2’,3,3’,4,4’,5-heptaclorobifenilo (PCB 170), 2,3’,4,4’,6-pentaclorobifenilo (PCB 119), 3,3’,4,4’-tetraclorobifenilo (PCB 77), 2,3,4,4’,5-pentaclorobifenolo (PCB 114), 2,2’,3,4,4’,5’ -hexaclorobifenilo (PCB 138), 2,2’,4,5,5’-pentaclorobifenilo (PCB 101), 2,2’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenilo (PCB 153), 2,2’,5,5’-tetraclorobifenilo (PCB 52), 2,2’,3,4,4’5,5’-heptaclorobifenilo (PCB 180), 2,4,4’-triclorobifenilo (PCB 28), 2,3,3’,4,4’,5 -hexaclorobifenilo (PCB 156), 2,3’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenilo (PCB 167), 2,3,3’,4,4’-pentaclorobifenilo (PCB 105), 2,3,3’,4,4’5,5’-heptaclorobifenilo (PCB 189), 3,4,4’,5-tetraclobifenilo (PCB 81) y 3,3’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenilo (PCB 169). El método creado por la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC) denominado AOAC 2007.01 fue utilizado como base de la presente experimentación (Association of Official Analytical Chemists, 2007). Todos los reactivos y materiales utilizados eran certificados y de alta pureza, grado LC/MS, óptima y grado pesticida de la marca Fisher. En adición, fueron seleccionadas como muestras para el desarrollo de este estudio cinco marcas de leche de vaca con un contenido de grasa de 3 % (leche entera) producidas en la República Dominicana. La metodología se llevó a cabo a través de las siguientes etapas: recolección de la muestra, preparación de la muestra y la técnica analítica.

Durante los meses de mayo a julio del año 2019, fueron seleccionadas cinco marcas distintas de leche entera de vaca de producción nacional comercializadas en los principales supermercados del Distrito Nacional. Tres lotes o producciones de cada marca de leche entera fueron seleccionados al azar. Los análisis de cada uno de los 15 lotes fueron repetidos tres veces, con un total de 45 muestras (ver figura 1).

Preparación de la muestra

La preparación de la muestra se desarrolló en tres partes: extracción, purificación y concentración (ver figura 2). En primer lugar, se vertieron 15 mL de leche en tubos de extracción y se agregaron 6 g de sulfato de magnesio (MgSO4) y 1.5 g de acetato de sodio (NaOAc), seguido de la adición de 15 mL de una solución de acetonitrilo (C2H3N) con 1 % de ácido acético (CH3CO2H). Se agitó vigorosamente por un minuto, y se centrifugó a 3,900 rpm por 8 min.

Luego, 8 mL del sobrenadante fueron transferidos a los tubos de extracción de fase sólida dispersiva (d-SPE) que contenían 150 mg de sulfato de magnesio (MgSO4), 50 mg de etilendiamina-N-propilo (amina primaria/secundaria, PSA), 50 mg de un sorbente C18 (sílice octadecil unido) y 50 mg de carbón activado grafitado (GCB). Después, fue agitado por un minuto y centrifugado a 3,900 rpm durante 8 min.

Posteriormente, la fase superior separada fue concentrada, y el solvente fue intercambiado por tolueno (C6H5CH3). Para esto, se calentó el extracto final a una temperatura constante de 60 °C hasta la evaporación del solvente y luego se agregó 1 mL de tolueno. Finalmente, esa solución fue transferida a viales de GC de 1.5 mL.

Técnica analítica

La determinación de la presencia de COP evaluados en las muestras de leche se llevó a cabo por la técnica GC/MS que es la recomendada por las normas, directrices y códigos de prácticas internacionales sobre alimentos del Codex Alimentarius para la identificación y confirmación de residuos de COP en los alimentos (Codex Committee on Pesticide Residues (CCPR), 2017). El equipo utilizado fue el GC/MS Clarus SQ 8C de la marca Perkin Elmer. Se inyectó, en modo split, 1 μL del extracto final en la columna Elite 5MS marca Perkin Elmer de espesor de la película de 0.25 µm, diámetro interior de 0.25 mm, longitud de 60 m y fase de 1,4-bis (dimetilsiloxi) fenileno dimetilpolisiloxano. El hidrógeno fue utilizado como gas portador y se mantuvo con un flujo constante de 1.5 mL/min. La rampa de temperatura del horno de la columna se inició a partir de 90 °C con un incremento de 3 °C/min hasta alcanzar 320 °C. El inyector se mantuvo a una temperatura constante de 250 °C, para un tiempo total de corrida de 75 minutos.

El detector MS fue utilizado en el modo de escaneo completo para evaluar el rango de COP posible en GC/MS, seleccionando un rango de masas que va desde los 50 a los 550 m/z, con una energía de colisión del electrón de 70 eV. La fuente de ionización utilizada fue la de impacto electrónico. La línea de transferencia y la fuente de ionización se mantuvieron a una temperatura de 300 °C y 320 °C, respectivamente.

Estándares de referencia

Fueron utilizados los compuestos naftaleno-d8 y acenafteno-d10 como estándar interno con una concentración de 40 ppm.

A modo de control de calidad, se preparó una solución que contenía una mezcla de estándares externos de referencia de los COP evaluados de marca Sigma Aldrich con una pureza entre 95.8 % y 99.8 %, y estos fueron estudiados bajo las mismas condiciones cromatográficas anteriormente descritas. Además, presentaron un límite de detección (LOD) de 0.010 ppm. Posteriormente, los cromatogramas y espectros de masas obtenidos de estos estándares externos fueron comparados con los que resultaron de las muestras.

Resultados y discusión

Selección de la muestra

La selección de leche procesada como muestra para el desarrollo de este estudio fue satisfactoria, debido a que los tratamientos usuales en la leche para consumo humano tales como la pasteurización, la esterilización y el procesamiento UHT no causan ningún efecto apreciable en el contenido de residuos de COP en esta matriz (Deiana & Fatichenti, 1992). Además, la evaporación e intercambio del solvente contribuyeron a la reducción o a la eliminación de interferencias y a la concentración de los analitos objetivo.

Método de extracción QuEChERS

El uso de sulfato de magnesio (MgSO4) y acetato de sodio (NaOAc) en el método de extracción QuEChERS fueron utilizados satisfactoriamente para remover el agua presente en las muestras. También, el uso de etilendiamina-N-propilo (amina primaria/secundaria, PSA) fue exitoso para eliminar ácidos grasos, otros ácidos orgánicos y azúcares, al igual que el uso del sorbente C18 (sílice octadecil unido) con el fin de remover interferencias no polares contenidas en las muestras.

Técnica analítica GC/MS

La utilización de la técnica analítica de GC/MS permitió la completa separación e identificación de todos los componentes presentes en las muestras, arrojando cromatogramas y espectros de masas característicos (ver figuras 3 y 4). Luego de realizar los análisis por medio de dicha técnica, en este estudio no se detectó la presencia de ninguno de los COP evaluados en ninguna de las muestras de leche de vaca.

Confirmación de resultados

Los espectros de masas obtenidos fueron corroborados con la biblioteca espectral de masas NIST y el registro de datos espectrales de masas Wiley (National Institute of Standards and Technology, 2018; Wiley, 2016), confirmando la ausencia de los COP evaluados en las muestras.

En adición, la solución de la mezcla de estándares de referencia de los COP evaluados fue analizada bajo las mismas condiciones que las muestras y esta mostró tiempos de retención (véase figura 5), espectros de masas (véase figura 6) e iones de fragmentación (véase tabla 1) específicos para cada compuesto. Dichos datos fueron comparados con los respectivos cromatogramas y espectros de masas obtenidos de las muestras y estos no coincidieron, confirmando que no había presencia de ninguno de los COP evaluados en las muestras de leche de vaca.

Conclusiones

En este trabajo se logró determinar que no hay presencia de los COP evaluados en ninguna de las muestras de leche de vaca de las principales marcas de producción nacional. Estos resultados pueden deberse a la reducción del uso y generación de los COP en el país, a raíz de las legalizaciones nacionales e internacionales que han sido implementadas con el fin de regular la aplicación de estos compuestos.

En adición, a diferencia de otros países de la región tales como Estados Unidos (Chen et al., 2017), Brasil (Ciscato et al., 2002), Argentina (Lorenzatti, Maitre, & Lenardon, 2003), Colombia (Lans-Ceballos, Lombana Gomez, & Pinedo-Hernández, 2018) y Chile (Muñoz, 2005) las muestras de leche de vaca producidas en la República Dominicana no suponen una fuente de exposición a los COP evaluados para las personas que consumen este producto. De igual forma, este estudio desempeña un papel muy importante en el aporte a las investigaciones sobre los niveles actuales de COP en la República Dominicana, ya que es el primer estudio de investigación sobre la determinación de los COP en leche de vaca producida y consumida en la República Dominicana.

Recomendaciones

Atendiendo a los resultados obtenidos en esta investigación, se recomienda realizar estudios con objetivos similares que evalúen otras sustancias clasificadas como COP, con el fin de tener una mejor estimación del contenido de COP en la leche de vaca producida en el país.

Asimismo, se sugiere ampliar el número de muestras, incluyendo otras marcas de leche producidas nacionalmente y con distinto contenido de grasa con el propósito de obtener resultados más completos y representativos.

Por último, se recomienda realizar estudios en otros alimentos y evaluar la presencia de los diferentes COP, para así conocer la exposición real de los consumidores a los alimentos contaminados con COP producidos en la República Dominicana.